gⅥ-cDNA融合噬菌体亲和选择

 

     1噬菌体文库的获取和纯化

    在每轮淘选循环中的起始部分，（富集的）Topl0F，细胞经辅助噬菌体被双重感染以便产生和纯化gⅥ—cDNAt噬菌粒颗粒，从而进行下一轮的淘选。在淘选过程中，如果没有特异的缓冲液且噬菌体对诱饵的亲和力较高（如免疫亲和筛选），此时经双重感染获得的噬菌体颗粒并不一定要纯化。

 

    2生物素化的诱饵的制备

    用不同的配体标准化淘选的一个方法是用普通的标记物（如生物素）来标记诱饵，或使用链霉亲和素包被的酶联免疫吸附实验（ELISA）的平板孔或小珠来淘选。两个有效的（氨基反应的）生物素化试剂是二硫化N—羟基丁二酰亚胺生物素酯（biotin disulfide N—hydrox—ysuccinimideester）和生物素化氨基己酸—N—羟基丁二酰亚胺（biotinamidocaproate N—hydroxysuccinimide）（Sigma）。与后者试剂相比，前者在生物素和诱饵之间有一个可切断的二硫键，它是在生物淘选过程中特异抽提（用50mmol/L二硫苏糖醇）噬菌体的试剂，整个生物素的水平可用HABA方法来评估。

 

    3用生物素化的诱饵的淘选过程

    在用生物素化的诱饵来亲和纯化gⅥ—cDNA噬菌体颗粒的标准过程中，用链霉亲和素包被的磁珠预处理噬菌粒文库，以便首先除去与链霉素非特异结合的噬菌体颗粒。在第三轮淘选后，个别克隆可用ELISA来分析或进行额外的淘选过程。然而，必须注意到成功的展示要求pⅥ融合蛋白定位在外周胞质上，正确地折叠并组合成完整的噬菌体颗粒。这样的话，如果表达pⅥ融合蛋白的结合者干扰了选择过程，那么将会稀释“非干扰”结合者的浓度。

 

    4免疫亲和淘选过程

    用抗血清来分离gⅥ—cDNA噬菌体颗粒，而且所需要的抗血清是微量的（微升数量的）。