TCA沉淀过滤法，斑点法

TCA沉淀——过滤法

1．为了检测放射性标记物结合蛋白质的掺入量，每个样本吸取一定量（通常为5／／1）加入盛有100t~lBSA溶液（1mg／m1）的1．5m1锥形管中。
2．每管加入lmll0％冰冷的三氯醋酸，混匀。
3．冰上孵育30min。
4．将玻璃纤维滤纸置于一适当的过滤器上，用少量的10％三氯醋酸真空过滤，预先湿润滤纸。
5．滴加样本于滤纸的中央，而末掺入标记物则通过滤纸除去，被TCA沉淀的蛋白质则吸附在滤纸上。
6．再用少量的10％三氯醋酸（数毫升）洗涤2次。
7．用少量的95％乙醇洗涤2次。
8．取下滤纸并让其干燥。将滤纸放在一张铝箔上，用红外线灯照射加速其干燥。将干燥的滤纸放入测量瓶中，加入闪烁液，计数cpm。
注：在三氯醋酸中加入非放射性标记的分子可降低检测的本底。例如氯醋酸中加入蛋氨酸可降低[35S]蛋氨酸的本底。

TCA沉淀——斑点法

1．为了检测放射性标记物结合蛋白质的掺入量，每个样本吸取一定量（通常为5ul）与5ulBSA（10mg／m1）溶液混合。
2．将混合后的样本滴在干燥的玻璃纤维滤纸中央，将滤纸片放在一浅盘或培养皿中。注意滤纸片在使用前应作好标记。
3．小心地用10％冷三氯醋酸（TCA）淹没滤纸片
4．在冰上或4℃孵育30min．
5．吸出平皿内的三氯醋酸，再加入新鲜的10％冷三氯醋酸，室温下孵育5min，期间不断震荡。再吸出三氯醋酸并重复2次。
6．吸出平皿内的三氯醋酸，再加入95％乙醇，室温下孵育5min，期间不断震荡。
7．取出滤纸片并让其干燥。将滤纸片放在一张铝箔上，用红外线灯照射加速其干燥。将干燥的滤纸片放入测量瓶中，加入闪烁液，计数cpm。
注：在三氯醋酸中加入非放射性标记的分子可降低检测的本底。例如，在三氯醋酸中加入蛋氨酸可减低[35S]蛋氨酸的本底。www.soogle-expo.com