凝胶电泳前的蛋白质烷化

 

    1．如果使用经免疫沉淀法得到的蛋白，按常规洗涤免疫复合物。尽可能*去除zui后的洗液。如果使用其他来源的蛋白，则将其转入20mmol／L的磷酸盐溶液中(pH7．0)，或直接在20／1l水中重悬蛋白。蛋白浓度应低于lmg／m1。

 

    2．加入20u1．5％SDS和20mmol／L DTI。

 

    3．加热至85C10min，仔细将上清液移入另一试管。

 

    4．加入10rd新鲜配制的0．2mmol／LN-乙基顺了烯二酰亚胺(NEM)，12．5mg／m1的水溶液为饱和溶液)，使用前临时配制。85℃温育10min，有利于NEM溶于溶液中。超声水浴亦可起作用，但是重复抽吸即足以促溶。由于溶液是饱和的，*液化不可能。另外，可将NEM溶于20retool／L乙酸钠中(pH 6．0)。

 

    5．置冰浴中60min。

 

    6．加入10ul 50％甘油，0．5mol／lp-巯基乙醇和0．001％的溴酚蓝。

 

    至此样品可以进行电泳。